UROLOGIA

 

TITULO : Métodos para Detectar el Virus del Papiloma Humano

AUTOR : Hubbard RA

TITULO ORIGINAL: [Human Papillomavirus Testing Methods]

CITA : Archives of Pathology & Laboratory Medicine 127:940-945, Ago 2003

MICRO : Las nuevas pruebas para la identificación de los distintos genotipos de HPV permitirán una mejor estadificación del riesgo de desarrollar cáncer cervical.

Metodologías para la detección de HPV

Métodos de sonda directa

El método de referencia para el análisis genómico del HPV es la técnica Southern blot. Otra prueba que emplea sonda directa es el ISH, que evalúa la presencia de ácido nucleico blanco o la expresión génica en un contexto histopatológico. Las sondas para ácidos nucleicos empleadas por este método son convertidas en derivativos en múltiples sitios. La detección se logra mediante técnica "sándwich", que involucra complejos estreptavidina-cromógenos.

Estos métodos son poco sensibles, requieren mucho tiempo y necesitan grandes cantidades de ADN muy purificado. El método ISH es el que presenta menor especificidad para la detección de secuencias de HPV en especímenes clínicos (72% para lesiones condilomatosas y 30% para cáncer invasor).

Amplificación de la señal

Los métodos de amplificación de la señal están protegidos por patentes intelectuales y no son de dominio público. La prueba de captura híbrida 2 (CH2) está incluida en esta categoría. Estos métodos aumentan la sensibilidad mediante la formación de capas multiméricas de moléculas informantes sobre sondas de ADN.

En la CH2 se utilizan sondas ARN específicas que son dirigidas hacia secuencias individuales del ADN, las cuales comprenden los genotipos de HPV a ser detectados. Se emplea un anticuerpo que es dirigido contra híbridos ADN-ARN (captura), y para la posterior detección, marcado con una molécula informante y visualizado por un sistema quimioluminiscente.

Según su grado de asociación con el cáncer cervical, los genotipos de HPV pueden ser agrupados en la CH2 como tipos de bajo riesgo (6, 11, 42, 43 y 44), y de riesgo intermedio/alto (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68).

Amplificación blanco

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite la multiplicación in vitro de regiones únicas de ARN, facilitando su detección. La amplificación blanco es la técnica para análisis de ADN más flexible y sensible de todas. Puede ser utilizada para detección, cuantificación de carga viral, determinación de secuencias de ADN y análisis de mutación. Esta técnica permite que múltiples secuencias blanco de ADN puedan ser analizadas simultáneamente.

La mayoría de los métodos PCR involucran el uso de secuencias patentadas de HPV que limitan su aplicabilidad en pruebas diagnósticas in vitro. La PCR se encuentra sujeta a contaminación ambiental, ya que el material previamente amplificado (los amplicones) puede contaminar especímenes negativos, obteniéndose resultados falsos positivos.

Sensibilidad y especificidad

No existe una única sensibilidad o especificidad para una prueba, sino un continuum de sensibilidades y especificidades. Variando el umbral de decisión, cualquier sensibilidad puede ser obtenida, desde 0% hasta 100%, y cada uno tendrá su correspondiente especificidad. El nivel ideal depende de las expectativas clínicas para la prueba.

Las técnicas de sonda directa ofrecen la menor sensibilidad para detectar secuencias específicas de ADN, mientras que la mayor sensibilidad se logra con la amplificación blanco. El método de amplificación blanco más sensible es la PCR cuantitativa en tiempo real (RQ-PCR). Poniendo los niveles de sensibilidad en perspectiva, la CH2 tiene menor límite de detección (1.0 pg de blanco/ml); esta concentración implica aproximadamente 120 000 partículas virales. El límite teórico inferior de detección de la RQ-PCR es de una secuencia blanco de ácido nucleico, pero el límite inferior práctico es probablemente mayor. La prueba diagnóstica molecular ideal debería poder diferenciar una secuencia blanco al nivel de un nucleótido simple, algo importante al analizar mutaciones. Las técnicas de amplificación blanco, la RQ-PCR y la secuencia de ciclos PCR directos son los más selectivos, son capaces de discriminar diferencias menores de secuencias del ADN blanco.

Las pruebas de menor selectividad tienen dificultad para diferenciar entre secuencias blanco similares con alto grado de homología de secuencias, como es el caso de los miembros de la familia HPV. Las pruebas de sonda directa y las de amplificación de la señal tienen tendencia a presentar reacciones cruzadas o hibridación cruzada.

Métodos de laboratorio empleados para determinar genotipos de HPV

Si bien la CH2 es extremadamente útil, puede distinguir entre familias de HPV de bajo y alto riesgo, lo cual es muy útil en ensayos clínicos, no provee información específica acerca de los genotipos de HPV presentes en un espécimen. La detección de genotipos individuales de HPV en especímenes cervicales podría servir para una más precisa estratificación del riesgo de desarrollar cáncer cervical.

Las áreas del ADN del HPV que muestran polimorfismo tipo-específico son de especial interés para el análisis de los genotipos. Existen varias regiones con variabilidad de secuencias tipo-específicas, pero el gen L1 de la región tardía que codifica una proteína mayor de la cápside parece ser la más polimórfica. Además, existen polimorfismos de secuencia en los genes E6 y E7 de las regiones tempranas. Estas diferencias de secuencias otorgan a los tipos individuales de HPV variados grados de potencial oncogénico y pueden ser explotadas para desarrollar pruebas moleculares diagnósticas tipo-específicas.

La PCR es la puerta de acceso a todos los métodos para detección de genotipos. Una vez que se logra un consensuado de iniciadores con PCR, la detección de genotipos individuales puede ser realizada por varios métodos, incluida RFLP (una prueba de hibridación reversa) o secuenciamiento de ciclos y asignación de genotipos por comparación de secuencias. Una alternativa es el uso de iniciadores de PCR genotipo-específicos, utilizados para identificar tipos individuales de HPV basándose en los polimorfismos E6 o E7.

Se han desarrollado pruebas PCR generales o consensuadas mediadas por iniciador para rastrear un amplio espectro de tipos de HPV en especímenes clínicos, utilizando una única reacción de PCR. Estas pruebas utilizan pares de iniciadores que son comunes a la mayoría de todos los tipos de HPV anogenitales.

Los ensayos que emplean sondas de línea detectan ADN amplificado genotipo-específico mediante hibridación selectiva con oligonucleótidos inmovilizados en membranas de nailon. Al emplear sondas de línea pueden clasificarse genotipos individuales de HPV con nivel de sensibilidad de hasta 100 atogramos. Este nivel de discriminación es útil para resolver genotipos individuales en infecciones mixtas.

Los métodos de polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) son usados para identificar patrones de restricción genotipo-específicos de HPV a partir de ADN amplificado en HPV de consensos post-PCR.

Los resultados del RFLP son a menudo difíciles de interpretar, especialmente cuando se encuentran infecciones mixtas. Dado que los fragmentos de restricción en la práctica no son identificados positivamente por hibridación específica (por ejemplo, por Southern blot), la identificación de bandas espurias puede provocar mayor incertidumbre al asignar genotipos.

La secuencia directa de ácidos nucleicos en los productos de las reacciones de PCR empleando iniciadores consensuados puede ser utilizada para distinguir genotipos de HPV presentes en especímenes clínicos. Esta tecnología permite obtener secuencias en genotipos de HPV aún no caracterizados, o en mutaciones de genotipos conocidos de HPV.

Métodos de laboratorio empleados para determinar carga viral de HPV

La mayoría de estos estudios requieren RQ-PCR. Todos los sistemas de RQ-PCR dependen de la detección y cuantificación de moléculas informantes fluorescentes, cuya señal aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de PCR en una reacción. Las técnicas que emplean RQ-PCR permiten el monitoreo continuo de los productos de PCR, dado que las sondas fluorigénicas dualmente marcadas emiten fluorescencia a medida que progresa la reacción de PCR.

La RQ-PCR es una técnica reproducible, rápida y aplicable a entornos clínicos, que permite cuantificar un rango dinámico superior a 7-log. Las reacciones pueden correr en modo multiplex con el uso de diferentes fluorocromos.

La literatura actual aún no muestra claramente la utilidad de la determinación de la carga viral de HPV.

Si bien la CH2 clasifica los genotipos de HPV en grupos de riesgo alto y bajo, la identificación de genotipos individuales de HPV en una lesión podría proveer una estratificación de riesgo individual, de utilidad para decisiones terapéuticas, estudios epidemiológicos y desarrollo de vacunas.

Las técnicas genotípicas permitirán descubrir nuevos tipos de HPV y evaluar las mutaciones dentro de los genotipos conocidos.

Las infecciones por tipos múltiples de HPV suelen asociarse con mayor riesgo de neoplasia intraepitelial cervical (CIN). Muchas lesiones cervicales de alto grado se asocian con HPV-16, HPV-18 o ambos, que poseen mutaciones en los loci E6 y E7, las cuales incrementen su potencial oncogénico.

Ref : INET, SAMET, UROLOG, GINECO, INFECTO