NEUMONOLOGIA

 

TITULO : Diagnóstico de Laboratorio de la Infección por Mycoplasma pneumoniae

AUTOR : Daxboeck F, Krause R y Wenisch C

TITULO ORIGINAL : [Laboratory Diagnosis of Mycoplasma pneumoniae Infection]

CITA : Clinical Microbiology and Infection 9:263-273, Abr 2003

MICRO : En los últimos años varias técnicas fueron adaptadas para el diagnóstico de la infección por Mycoplasma pneumoniae, fundamentalmente en el campo de la biología molecular.

Introducción

En la mayoría de los estudios, entre 10% y 30% de los casos de neumonía extrahospitalaria son producidas por Mycoplasma pneumoniae, que representan menos del 10% de las infecciones por este patógeno. La mayoría de los pacientes presentan traqueobronquitis o compromiso del aparato respiratorio superior y el 15% de las infecciones son asintomáticas. La neumonía por M. pneumoniae es atípica, caracterizada por su inicio gradual asociado con cefalea, mialgias, odinofagia y tos seca. El recuento leucocitario con frecuencia es normal o se encuentra moderadamente elevado. Investigaciones recientes confirmaron que los hallazgos clínicos y de laboratorio son insuficientes para distinguir entre neumonía por micoplasma y neumonía por otros patógenos. La primera es más frecuente en niños y adultos jóvenes. La infección generalmente tiene una evolución benigna, incluso sin terapia antibiótica adecuada. Las manifestaciones extrapulmonares son menos frecuentes y pueden poner en riesgo la vida. En la presente exposición los autores analizan los métodos actualmente utilizados para el diagnóstico de infección por M. pneumoniae, con especial énfasis en los métodos moleculares.

Serología

La serología es una herramienta importante en la identificación del patógeno. El papel de la serología en la evaluación de rutina se debe en parte a la facilidad de la toma de muestras y la disponibilidad de pruebas. El nivel de IgG específica aumenta lentamente, y alcanza los mayores valores a las 5 semanas de iniciada la sintomatología. Luego de la infección, estos anticuerpos permanecen elevados durante 4 años. Por lo tanto, los niveles bajos pueden indicar enfermedad pasada o estadios tempranos de infección aguda. En este caso debe analizarse una segunda muestra a las 2 o 3 semanas para demostrar el incremento en el título de anticuerpos. Para establecer el diagnóstico se requiere la cuadruplicación de los valores.

La detección separada de IgM o IgA puede acelerar el diagnóstico. La IgM aparece durante la primera semana y alcanza valores máximos a la tercera semana. Sin embargo, estos anticuerpos no son producidos en forma constante por los adultos, motivo por el cual los resultados negativos no descartan la infección en este grupo. En los pacientes pediátricos, sin embargo, la medición de la inmunoglobulina es útil. Estudios recientes indican que la detección de la IgA específica ofrece mayor precisión diagnóstica. La determinación de estas dos inmunoglobulinas se efectúa fundamentalmente mediante enzimoinmunoensayo (ELISA). Recientemente se desarrolló una técnica de inmunotransferencia que es actualmente la más específica para la detección de anticuerpos contra el patógeno. El hallazgo de anticuerpos específicos en el líquido cefalorraquídeo ofrece información adicional ante la sospecha de compromiso nervioso. Un trabajo reciente reveló que podría existir síntesis intratecal de IgG e IgM específicas.

Técnicas de cultivo

Con propósitos científicos, el cultivo de M. pneumoniae se realiza fundamentalmente en formulaciones sin células. Para evitar el crecimiento de otros patógenos el medio debe contener un betalactámico de amplio espectro y un antifúngico. Dada la vulnerabilidad del agente, las muestras deben mantenerse en un medio apropiado y el tiempo de transporte no debe exceder las 4 horas. Sin embargo, cuando el traslado se prolonga, la viabilidad de micoplasma se puede mantener con temperaturas de aproximadamente 4°C. El aislamiento del microorganismo es lento e insensible, por lo que no es recomendable en el diagnóstico de rutina. La dificultad del cultivo radica en los requerimientos nutricionales del agente. El período de incubación depende del inóculo inicial y varía entre 4 días y varias semanas. En caldo de cultivo el crecimiento del patógeno produce un color amarillento debido a la utilización de glucosa. En las placas de agar, las colonias presentan una apariencia granulada. Sin embargo, no es posible la diferenciación entre micoplasma sobre la base de la morfología de las colonias. Para evaluar la sensibilidad del aislamiento, la cantidad de micoplasma se expresa como unidades formadoras de colonias (UFC), unidades cambiantes de color (UCC) o cantidad de copias. Una UFC contiene entre 10 y 1 000 células y una UCC presenta entre 10 y 100 microorganismos. En la infección aguda se pueden detectar entre 102 y 104 UCC/ml en las secreciones respiratorias. Los medios de cultivo permiten la detección de 105 UFC/ml. El empleo de células HeLa 229 aumenta la sensibilidad y acelera el crecimiento bacteriano. Con la aplicación de este método el crecimiento puede ser determinado luego de 5 días de incubación mediante inmunofluorescencia, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o detección de antígenos. A pesar de la escasa sensibilidad del cultivo, el aislamiento del patógeno amplió la información sobre la patogénesis de las manifestaciones extrapulmonares.

Detección directa de antígenos e hibridación del ácido nucleico

Las pruebas para la detección directa de antígenos ofrecen una sensibilidad de aproximadamente 104 UFC/ml. Esta opción diagnóstica, aunque no es recomendable para el diagnóstico de manifestaciones extrapulmonares, es una alternativa conveniente para la detección del patógeno en secreciones respiratorias cuando no hay equipamiento para PCR disponible. La hibridación con sondas específicas fue la primera aplicación molecular en el diagnóstico de M. pneumoniae. La hibridación provee una sensibilidad similar a la del ELISA. Uno de los sistemas disponibles ofrece grados elevados de sensibilidad y especificidad para la detección de micoplasma en esputo, sin embargo, su valor se ve limitado en las muestras provenientes de hisopado faríngeo. Las pruebas de hibridación fueron reemplazadas por la PCR y métodos relacionados debido a su mayor sensibilidad.

Amplificación del ácido nucleico

La sensibilidad de la PCR supera la de los métodos que no están basados en la amplificación del ADN. Los procedimientos de PCR de un paso generalmente ofrecen un nivel de detección de 102 a 103 copias por ml de muestra. La sensibilidad puede aumentar mediante el empleo de la PCR anidada, que comprende la reamplificación de un producto de la PCR. El método permite la detección de 30 a 100 fg de ADN que corresponden a 10 a 100 organismos. Por lo tanto, la aplicación de esta técnica puede aumentar la sensibilidad en 102 veces. La contaminación cruzada de los productos de amplificación es el principal problema del diagnóstico por PCR, aunque la aplicación de las recomendaciones puede reducir la contaminación a menos del 0.5%. La hibridación de los productos de la PCR aumenta la sensibilidad del procedimiento. La especificidad de la PCR depende de la elección de los oligonucleótidos iniciadores y de las condiciones de realización de la reacción. La PCR sola no siempre es suficiente para el diagnóstico de infecciones respiratorias por M. pneumoniae. Varios estudios demostraron escasa correlación entre la respuesta de los anticuerpos y los resultados positivos derivados de la PCR en pacientes con neumonía por micoplasma.

Además de la PCR y de la PCR anidada, otras técnicas de amplificación fueron adaptadas para el diagnóstico de M. pneumoniae. La PCR multiplex permite la detección simultánea del patógeno y de otros agentes respiratorios. La PCR en tiempo real ofrece una sensibilidad similar a la de la PCR anidada. El método permite la cuantificación del producto amplificado de la PCR, combinada con una reducción del tiempo práctico. La sospecha de manifestaciones extrapulmonares de la infección representa una aplicación importante de los métodos moleculares. La mayoría de los sitios extrapulmonares no ofrecen un ambiente favorable para el crecimiento de micoplasma. Dado que la bacteria probablemente esté presente en pequeñas cantidades, la aplicación de métodos moleculares puede aumentar la sensibilidad. Las técnicas de amplificación del ARN también son prometedoras respecto del diagnóstico del patógeno. La elevada sensibilidad del procedimiento se debe a la importante cantidad de copias de ARNr (más de 103) por célula bacteriana. Debido a que el ARN es degradado rápidamente, su detección es más indicativa de micoplasma viable en comparación con el ADN.

Recientemente se desarrolló un procedimiento de transcripción inversa acoplada a PCR (RT-PCR) para la detección de M. pneumoniae y de otros 8 patógenos respiratorios. También existen técnicas de amplificación del ARN que todavía no se utilizaron en el diagnóstico de micoplasma pero que son eficaces en la detección de otros agentes infecciosos. Las pruebas de amplificación mediadas por transcripción probablemente mejoren el diagnóstico de micoplasma.

Conclusión

En los últimos años varias técnicas fueron adaptadas para el diagnóstico de la infección por M. pneumoniae, especialmente en el campo de la biología molecular. La PCR es en la actualidad el método de elección para la detección directa del patógeno, ya que reemplaza la hibridación y la determinación directa de antígenos debido a su mayor sensibilidad. Asimismo, variaciones de la PCR permiten aumentar la sensibilidad diagnóstica, la detección simultánea de diversos organismos y el monitoreo del proceso de amplificación.

 

Ref : INET, SAMET, NEUMO, INFECTO